Our First Paper Is Published (Moon) / 研究室初の論文を発表（ムーン）

In January 2016, I started my lab all by myself here. For the first 6 months, I did everything including making LB, purchasing a CO2 tank for CO2 incubators, and etc. I remember I was picking E.coli colonies at midnight wondering if it would be ever really possible to publish a paper from that point. The lab room was really nearly empty. However, the Institute gave me a starting package of two staff scientists and one lab tech as well as a good amount of money to purchase equipment. I really appreciate the Institute for this scientific freedom, as it is pretty common that a new PI has to take reagents, equipments, and even some people left from a previous lab. My situation was much better than that.

First thing I did was to re-establish what I was doing as a postdoc in my new lab such as the cell culture systems including iPS cell cultures, molecular biology set-ups to construct plasmids, the digital PCR system to quantify genome editing outcomes, and etc. Of course I had to start something new, so I tried some ideas while setting-up the lab. One of them was to compare the HDR and NHEJ activities of WT Cas9 and Cas9 variants including eSpCas9(1.1) or SpCas9-HF1. It was already clear at that time that those Cas9 variants have altered interactions with the genomic DNA, but I just gave it a try without thinking too much (hopefully we will publish other ideas I tested during this period soon). It was obvious that the variants have different activities on the first try, so I started testing some other conditions such as gRNAs with different lengths. About half a year ago, we finished writing a paper that was close to the published version.

After submitting the paper, I decided to present our data at conferences in Japan and the US. Luckily, we had chances to give oral presentations at the Annual Meeting of the Japanese Society for Genome Editing as well as the Cold Spring Harbor Meeting. Those were the best opportunities to introduce not only our science but also our lab and myself to scientists in this field. Especially, at the Cold Spring Harbor Meeting, I asked the audience to let our paper be accepted if they were reviewers to help a junior faculty. Indeed it turned out that at least two of the three reviewers were there at the meeting (they stated so in their review comments). I am not sure if my begging worked out or not, but it should not have been disadvantageous that the reviewers knew me as a person and our work before they read the paper.

The record says our paper was submitted on January 19th, 2018, but that was a result of resubmission of the paper after massive revision experiments and changing the paper title from last summer. The revision experiments were not easy, but the reviewers' comments were all fair, and I felt even educational for a junior faculty like me. Initially, we had only eSpCas9(1.1) and SpCas9-HF1, but ended up in including HypaCas9 after the revision. We also tested the knock-in efficiency of an EGFP expression cassette in AAVS1 in addition to single-nucleotide substitutions that we had already included in the paper. Those revision experiments much improved the quality of the paper, so we really appreciate the journal and the reviewers in that regard.

First, Szuyin, then Tomoko, and finally Gou joined the lab to help the project. Especially, Tomoko drove the project as her own. I am 100% for collaborations, but in this case this time, we were able to publish the paper without anybody outside the lab as an author. We hope this somewhat proves that we can do it by ourselves.

So this is definitely something to celebrate, and we did. However, that means that is done, and we have to move on. Yes, publishing is one step forward, but things keep coming. I keep trying to enjoy the ride.

　2016年1月に研究室が始まってから約半年間は、自分一人しかいなかったのでLBを作ったり、CO2インキュベーターを動かすためのCO2ボンベを購入したり、全てを自分でやっていました。夜中に爪楊枝で大腸菌のコロニーをつっつきながら、こんなんで論文が出せる日が本当にやってくるのだろうか、とぼんやり考えていたのをよく覚えています。本当にほぼ空の部屋で、一人で始めたので。ですが、研究員を雇う予算と人事権を与えていただきましたし、備品を買う資金も与えていただきました。真の意味で自由にやれる環境を与えてくれた、研究所には感謝しかありません。やれ前の研究室の人がまだ残っているだ、やれ前の研究室の試薬や備品が置きっ放しだ、というのはよくある話なので。ありがたいことでした。 　当時まず、iPS細胞はじめ細胞培養の設備と、プラスミド作製などの分子生物学的実験をするための環境、そしてゲノム編集結果を評価するためのデジタルPCRなどの、ポスドク時代にしていた実験の系を再現することから始めました。もちろん、そこから何か新しいことを始めないといけないので、これらの系を立ち上げるための条件検討をするついでに、いろいろなアイデアを試していきました。そのうちの一つが、eSpCas9(1.1)やSpCas9-HF1の持つHDRとNHEJ活性をWT Cas9と比較する、というものでした。確かに、これらCas9改変体とDNAとの相互作用様式が異なることは当時から明らかでしたが、正直なところこれらを試したのは、まずはただただやってみた、というのが正しいです（他に試したアイデアもなんとか論文にしなくてはなりません）。すると、Cas9改変体とWT Cas9ではかなり活性が異なることが明らかになってきて、もっといろいろ試してみよう、ということになり、gRNAの長さを変えるなどして、まず昨年半ばには発表された論文に近い形のものになりました。 　昨年論文を投稿した段階で、学会でも発表して結果を知ってもらおうと考え、国内では日本ゲノム編集学会年会、海外ではCold Spring Harbor Meetingに参加しました。幸いなことに両方の学会で口頭発表の機会をいただきましたので、実験結果だけではなく、そもそも私という研究者と、当研究室、当研究所の存在を知ってもらう絶好の機会となりました。特にCold Spring Harbor Meetingでは、発表の最後に聴衆に「研究室始めたてのPIを助けると思って、みなさんもしレビューアーになったら論文通してください」とお願いしましたが、実際に３人いたレビューアーのうち、２人は明確にその学会にいたとコメントしていました。お願いが役に立ったのかは不明ですが、事前に聞いたことがある、というのは不利には働かないのではないかと推測します。 　論文の記録上は2018年1月19日に投稿となっていますが、その前年の夏から大幅なリバイス実験をしてタイトルも変えて別の論文として再投稿した結果です。リバイスは大変でしたが、レビューアーのコメントはとてもフェアで、新米PIにとって教育的であったとすら思います。最初はeSpCas9(1.1)とSpCas9-HF1だけでしたが、投稿したりしている間にHypaCas9も発表されたので、HypaCas9も取り入れたり、一塩基置換だけではなくてAAVS1へのEGFPノックインも検討したりと、論文としての質も格段に高まったと思います。そういう意味では、NARとレビューアーに感謝しています。

　途中から、まずは許さん、次に加藤さん、そして高橋さんが加わって手伝ってくれるようになりました。特に加藤さんが、主体的に実験を進めてくれました。私は共同研究には大賛成で積極的に進めたいと思っていますが、結果としてこの論文は私の元ボス達や他の大御所の人達が著者になることなく、私達研究室構成員だけで出すことができました。自分達だけでもやれることを、多少なりとも示せたかもしれません。

　というわけでとてもめでたいのですが、また次です。論文が出たら確かに一段落ですが、全く終わりではなく、次から次へと続いていくのを実感しています。鋭意努力します。