大規模クローン単離技術をSTAR Protocolsで発表/ Large-Scale Single-Cell Cloning Method Is Published in STAR Protocols
私達は昨年、ゲノム編集した細胞から2,600以上のクローンを樹立し、その遺伝型を解析した論文を報告しました（Takahashi et al., iScience 2022）。この際に確立した、多数のゲノム編集クローンを樹立する手法について、プロトコル論文として発表する機会を得ました。そこで今回、プロトコルを整理して、論文として発表しました。
シングルセルクローニングは、ゲノム編集された細胞クローンを単離するための最もシンプルな方法ですが、一度の実験で多くのクローンを得ることは困難でした。そこで私達は、オンチップテクノロジーズ社の協力のもと、多数のゲノム編集クローンを単離する手法を開発しました。
本手法は、以下の3つのステップから構成されています。
1. Cas9とEGFPを共発現するプラスミド(px458-HypaCas9*)と、ドナーDNAをトランスフェクションする。
2. Cas9を発現する細胞のみを単離するために、EGFP陽性細胞をマイクロ流体セルソーター（On-Chip Sort）で選別する。
3. 画像認識による正確な1細胞自動分注が可能なOn-chip SPiSを用いて、1細胞分注を実施する。コンフルエントになるまで細胞を培養する。
この手法では、1回の実験で80以上のゲノム編集クローンを樹立することができます。このプロトコルは、Base EditorやPrime Editorにも応用できる可能性があり、ゲノム編集を効率化させると期待されます。
*pX458-HypaCas9 (Addgene#190604) https://www.addgene.org/190604/
文責：高橋 剛
We reported a paper in which we established more than 2,600 clones from genome-edited cells and analyzed their genotypes last year (Takahashi et al., iScience 2022). Related to that paper, fortunately we have this opportunity to publish the protocol for large-scale cloning of genome-edited cells.
Single-cell cloning is the simplest strategy to isolate genome-edited cell clones, although it has been difficult to obtain many clones in one-time experiment. Therefore, we developed a method to isolate large-scale genome-edited clones with the collaboration of On-chip Biotechnologies Co., Ltd.
This method paper consists of the following 3 steps.
1. Transfection of plasmid to co-express Cas9 and EGFP (pX458-HypaCas9*) with donor DNA.
2. Sorting of EGFP-positive cells with a microfluidic cell sorter (On-Chip Sort) to select cells that expressed Cas9.
3. Single-cell dispensing using the single particle isolation system (SPiS), a single-cell auto-dispensing device with image recognition technology. Culture cells until they become confluent.
Using this protocol, we can establish more than 80 genome-edited clones in a one-time experiment. This protocol may also be applicable to Base Editing and Prime Editing.
*pX458-HypaCas9 (Addgene#190604) https://www.addgene.org/190604/
Written by Gou Takahashi
