ゲノム編集結果の１細胞レベル解析結果をiScience誌に発表 / Study of Genome Editing Results in Single Cells Is out at iScience

　CRISPR-Cas9などを用いて、相同組み換えを起こし、狙った通りのゲノム編集を起こそうとしても、実際にはなかなか全てが思い通りの編集にはなりません。特に、組換えを狙った部位での、望んでいない挿入や欠失変異は非常に頻繁に起こります。私はポスドクのときからiPS細胞のゲノム編集を繰り返していますが、片方のアリルに望んだ組換えが起きた細胞でも、もう片方のアリルに挿入・欠失変異が入っており、実験に使えずに落胆、という経験を何度もしてきました。そういった経験から、「個々の細胞でゲノム編集が起きるパターンは絶対偏ってる」と思っていました。ですが、なかなかその検証の手立てがなく、いつか詳しく調べたいとずっと考えていたのですが、うちの研究所のしかも同じ階に精密自動１細胞分注機である、SPiSがあることを知り、じゃあやるしかない！と思って研究をはじめました。

　学生の近藤さん、前田さんが非常に熱心に実験を進めてくれ、高橋さんが現場の指揮をとりながらまとめ上げてくれました。森下さんはじめ、On-Chip Bioの方々にも大変お世話になりました。

　ゲノム編集したHEK293T細胞、HeLa細胞、PC9細胞のクローンを合計2,600個以上単離して解析することができました。その結果、Cas9やgRNAを発現しているにも関わらず、ゲノム編集が全く起きない細胞集団と、標的アリルが全て編集される細胞集団に二極化することを見出しました。また、標的アリルが部分的にHDRで編集されることは非常に稀で、HDRはNHEJを伴いやすいことも明らかにしました。こうした結論は、私が経験してきて得た肌感覚からも非常に納得のいくものでした。ヒトiPS細胞では、HDRが起きる頻度は全体からするとかなり低いにも拘らず、かなりの頻度でHDRがホモで起きた細胞が得られてきたのですが、同様の現象をこれら培養細胞でも統計的に意味のある形で確認することができました。

　もともと、iPS細胞でゲノム編集が偏って起きているな、と感じたのが研究の動機ですが、iPS細胞はクローン単離に手間がかかるため、今回の研究では解析の対象としませんでした。次は個々のヒトiPS細胞でゲノム編集がどのように起きるかを検討したいと思います。高橋さん、近藤さん、前田さん、おめでとうございます！

Even when we try to introduce specific genome editing via homologous recombination induced by CRISPR-Cas9 or other tools, the results will never be as desired. Especially, insertions and deletions at targeted sites as by-products are quite frequent. I have been working on genome editing in human iPS cells since I was a postdoc, and experienced multiple cases where one allele was correctly targeted but the other allele was disrupted by insertions or deletions. I was disappointed every time of that, because these cells could not be used in functional experiments. Through these experiences, I had had a gut feeling that "Genome editing patterns in individual cells are definitely biased!", but I never had a way to directly address that possibility. However, I realized that we have a precise automated single cell dispensor, SPiS, in our Institute, even on the same floor, so we decided to start this project.

Daiki and Minato work hard to push the project, and Gou managed the team effort. Yuji and the On-Chip Bio group kindly helped our project too.

We were able to isolated more than 2,600 clones of genome edited HEK293T cells, HeLa cells, and PC9 cells, and analyzed their genome DNA sequences. As a result, we revealed that the binary nature of genome editing, that is, individual cells tend to undergo either completely no editing at all or full editing in all the target alleles. Moreover, we found that HDR is often accompanied by NHEJ, and it is rare that cells undergo partial editing in which only a part of the target alleles are edited by HDR. These findings are consistent with what I had experienced in almost 10 years of my career as a genome editor. I have isolated human iPS cells homozygously targeted by HDR several times, but it seemed that it was way more than expected based on the overall frequency of HDR. In this study, we were able to address this bias in a statistically meaningful way.

Although the original motivation of this study was derived from genome editing in human iPS cells, we could not use iPS cells as a target material, as cloning of human iPS cells is not easy. We are currently working to monitor genome editing induction pattern in individual human iPS cells too. Anyway, congratulations to Gou, Daiki, and Minato!