Our First Paper Is Published (Sun) / 研究室初の論文を発表（サン）

Our very first paper from the lab was published in Nucleic Acids Research. In this study, we analyzed the balance between HDR and NHEJ induced by various Cas9 variants and modified gRNAs. These Cas9 variants such as eSpCas9(1.1), SpCas9-HF1, and HypaCas9 as well as modified gRNAs including tru-gRNAs were originally developed to reduce off-target events induced by the original CRISPR/Cas9 system. These improved Cas9 and gRNAs basically alter how the Cas9-gRNA complex interacts with the genomic DNA, so that Cas9 cleaves the genomic DNA only when the genomic DNA and gRNA sequences truly match. We speculated that the modified interactions also affect the HDR/NHEJ ratio induced by CRISPR/Cas9, and actually they do.

Cas9 transitions from the inactive state to the active state by recognizing base-pairing between the genomic DNA and a gRNA. This transition works as a conformational checkpoint to secure the fidelity of Cas9, as Cas9 transitions into the active state only when the genomic DNA and gRNA match. The Cas9 variants and modified gRNAs make this conformational checkpoint more stringent, that is, more sensitive to mismatches in the DNA/RNA heteroduplex.

What we found is the level of this checkpoint affects the activities of HDR and NHEJ in different ways. With many gRNAs, a slight increase of the threshold for the checkpoint brings the peak activity of NHEJ, whereas a bit further increase brings the peak activity of HDR. A too much increase killed the activities of both HDR and NHEJ. Therefore, there seems sweet spots for many gRNAs to achieve the best HDR/NHEJ ratio. We see basically the same trends in both single-nucleotide substitutions and a multi-kb DNA fragment knock-in by HDR. However, we also have to mention that there were some gRNAs with which the HDR and NHEJ activities were very well co-related to each other, and no sweet spot was found. We still do not know what the differences are between these two types of gRNAs. We do not know why and how the conformational checkpoint level determines the HDR/NHEJ balance either. There are still a lot of open questions remained.

However, we believe that it is still practically important to know that the Cas9 variants tend to have a better HDR/NHEJ ratio than the original Cas9 does. Among the three variants, HypaCas9 was the best. We now use HypaCas9 instead of WT Cas9 to induce HDR in the lab. The CRISPR/Cas9 system is originally an adaptive immune system in bacteria and archea. It is no surprise that the original system is not optimal for genome editing in mammalian cells. There still seems to be a lot of things we can do to improve the CRISPR/Cas9 system.

　研究室初の論文がNucleic Acids Researchに発表されました。この論文で私達は、eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1、HypaCas9といったCas9改変体、およびtru-gRNAを含む改変型gRNAの持つHDR活性とNHEJ活性のバランスを解析しました。これらの改変は、もともとのCRISPR/Cas9の持つオフターゲット活性を軽減するために開発されました。これらのCas9改変体および改変型gRNAは、基本的にCas9-gRNA複合体とゲノムDNAの相互作用様式を変化させ、ゲノムDNAとgRNAが正しく合致したときにだけにゲノムDNAを切断するように設計されています。私達は、この変化したCas9-gRNA複合体とゲノムDNAの相互作用が、CRISPR/Cas9の誘導するHDR/NHEJ比にも影響を与えるのではないかと予測しました。そして実際その通りだったわけです。

　Cas9はゲノムDNAとgRNAの塩基対合を認識し、不活性状態から活性状態に遷移することによって機能します。この遷移がゲノムDNAとgRNAとの塩基対合が正しく起きたときにのみ起こることが、Cas9のconformational checkpointとして機能し、Cas9の正確性を担保しています。改変型Cas9およびgRNAは、このconformational checkpointの閾値を高め、より厳密にしています。つまりDNA/RNAの塩基不対合により感度が高い状態になっているわけです。

　私達は、このチェックポイントの強度が、HDRとNHEJ活性にそれぞれ異なるレベルで影響を与えることを見出しました。検討したgRNAの多くで、わずかにチェックポイントの強度を高めると、NHEJ活性がピークとなり、さらに高めるとHDRの活性がピークとなることを明らかにしました。チェックポイント強度を高めすぎると、HDRもNHEJも起こらなくなっていしまいます。これらの結果は、多くのgRNAについて、HDR/NHEJ比を高めるためにconformational checkpointの強度のsweet spotが存在することを示唆しています。HDRによる１塩基置換導入でも、数kbpのDNA断片のノックインでも同様の効果が認められました。しかし、同時にいくつかのgRNAに関しては、誘導されるHDRとNHEJが互いに非常に相関しており、sweet spotが全く存在しなかったことにも注意が必要です。このようにConformational chekpointの強度の変化に、異なる反応を示す二種類のgRNAのパターンがあることが明らかになりましたが、この二種類の違いが何に由来するのか、明らかになっていません。そもそも、なぜconformational checkpointの強度がHDRとNHEJのバランスに影響を及ぼすのかも不明です。まだまだわからないことが沢山あります。

　しかしながら、本来のCas9に比較してCas9改変体が高いHDR/NHEJ比を生み出すということは、実用的に重要であると考えています。検討したこれら三種類のCas9改変体の中では、HypaCas9が最良のHDR/NHEJ比をもたらしました。CRISPR/Cas9は、もともと細菌あるいは古細菌の獲得免疫機構であることを考えれば、オリジナルのCRISPR/Cas9システムが必ずしも哺乳類細胞におけるゲノム編集に最適ではないとしても、全く驚くことではないかと思います。CRISPR/Cas9システムを改良するために、まだまだやれることが沢山ありそうです。