高効率iPS細胞クローン単離手法開発と個々のiPS細胞に起きるゲノム編集結果解析の成果を発表 / High-throughput method to isolate human iPS cell clones and genome editing outcomes in single iPS cells are published

　ゲノム編集結果はほとんどの場合、細胞集団で解析されるのですが、私達は以前から１細胞ごとに起きる結果に着目して解析してきました。今のところ、内在性のゲノムDNA配列をゲノム編集により改変し、それを直接１細胞中で検出することは技術的に難しいため、１細胞由来のクローン中のゲノム編集結果を明らかにすることで、１細胞ごとに起きたゲノム編集結果として解釈してきました。 　2022年には、On-chip SPiSという機械を用いて、HEK293T細胞などの培養細胞株に起きるゲノム編集結果の１細胞解析を実施し、iScience誌に発表しました。ところが、同じやり方でヒトiPS細胞クローンを単離しようとしても、細胞死が頻繁に起きてしまい、成功しませんでした。そこで、ヤマハ発動機様が、精密な画像解析と緻密な細胞操作を可能にする、CELL HANDLERという装置を作製されていることを知り、共同研究をさせていただきました。最終的に、iPS細胞が安定して増殖しやすい、マトリゲルという細胞外基質をドーム状にして、その中でゲノム編集したiPS細胞を、１細胞から細胞塊を形成するまで増殖させ、その後CELL HANDLERによって細胞塊を単離する、という手法を開発しました。この手法自体、高効率なiPS細胞クローン単離技術として有用であると考えています。

　この手法で、合計で1,000個以上のヒトiPS細胞クローンを単離することに成功し、それぞれのゲノム編集結果を解読しました。その結果、ヒトiPS細胞でも、培養細胞中で観察されたような、全く編集されない細胞と、両アリルともに編集される細胞、という二極化する傾向を見出すことができました。さらに、挿入や欠失変異についても、同じ細胞中では例えば同じ８塩基欠失が両アリルに起こりやすいなど、同一の配列改変が両アリルに起こりやすい傾向があることを見出しました。これらの結果をStem Cell Research & Therapy誌に発表しました。

　培養細胞を使って１細胞解析を始めた当初から、ずっとiPS細胞でも同じ実験をしたいと考えていましたので、やっと達成できてよかったです。もうラボを巣立ってしまいましたが、高橋さんと前田さんが実験系を立ち上げてくれ、引き継いだ篠﨑さんが配列データの解析を進めてくれました。そして、ヤマハ発動機の原田さんと伊藤さんが、CELL HANDLERの条件設定から操作までを実施してくださいました。共同研究の手続きなど、もちろん他にも多くのヤマハ発動機の方々にお世話になりました。みなさん、ありがとうございました。そしておめでとうございます。

　一度マトリゲルのドームを宅配で送ったことがあったのですが、振動に耐えられずに崩れてしまったため、ヤマハ発動機社のある浜松まで、細胞入りマトリゲルドームが配置されたプレートを何度か持参しました。浜松いいところでしたし、たまの遠足としていい思い出にもなりました。

Genome editing outcomes are typically analyzed at the population level, but we have long focused on analyzing the results occurring in individual cells. Currently, it is technically challenging to modify endogenous genomic DNA sequences via genome editing and directly detect these changes within a single cell. Therefore, we have interpreted the genome editing results observed in clones derived from a single cell as representing the outcomes occurring in that individual cell.

　In 2022, using a machine called On-chip SPiS, we performed single-cell analysis of genome editing outcomes in cultured cell lines such as HEK293T cells and published the results in iScience. However, attempts to isolate human iPS cell clones using the same method frequently resulted in cell death and were unsuccessful. We then learned that Yamaha Motor Co., Ltd. had developed a device called the CELL HANDLER, enabling precise image analysis and meticulous cell manipulation, and initiated a collaborative research project. Ultimately, we developed a technique where we formed a dome-shaped structure using Matrigel, an extracellular matrix conducive to stable iPS cell proliferation. Within this structure, we expanded genome-edited iPS cells from a single cell until they formed cell clusters. Subsequently, we isolated the cell clusters using the CELL HANDLER. We believe this technique itself is useful as a highly efficient method for isolating iPS cell clones.

　Using this method, we successfully isolated over 1,000 human iPS cell clones in total and deciphered the genome editing results for each. The results revealed a binary tendency in human iPS cells as well, similar to what is observed in cultured cells: cells that are completely unedited and cells whose alleles are both edited. Furthermore, we observed that identical insertions and deletions also tended to occur in both alleles within the same cell. For example, the same 8-base deletion was frequently observed in both alleles. We published these results in Stem Cell Research & Therapy.

Ever since we began single-cell analysis using cultured cells, I had always wanted to perform the same experiments with iPS cells. I am very pleased to have finally achieved this. Although they have left the lab, Dr. Takahashi and Maeda-san established the experimental system, and Shinozaki-san, who took over, advanced the sequence data analysis. Furthermore, Dr. Harada and Dr. Ito from Yamaha Motor Company handled everything from setting up the CELL HANDLER conditions to its operation. Of course, many other individuals at Yamaha Motor Company also assisted us with procedures for the collaborative research. Thank you all very much, and congratulations.

　We once tried shipping a Matrigel dome by courier, but it collapsed due to vibration. So, we ended up bringing plates containing the Matrigel domes with cells several times to Hamamatsu, where Yamaha Motor is located. Hamamatsu was a nice place, and it became a good memory as an occasional field trip.